Imagerie de l’état redox mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique

Résumé

Source : Katsalifis, A., et al. Imagerie en direct de l’état redox du glutathion mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre l’imagerie de l’état redox mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur fluorescent ratiométrique. En appliquant deux longueurs d’onde d’excitation au microscope à fluorescence, le rapport d’intensité de fluorescence est mesuré pour évaluer l’oxydation mitochondriale. Le protocole comprend une stimulation du N-méthyl-D-aspartate (NMDA) pour induire l’afflux de calcium et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), suivie d’un étalonnage à l’aide d’agents oxydants et réducteurs pour quantifier l’oxydation mitochondriale induite par le NMDA.

Protocole

1. Chargement des cellules avec du perchlorate d’ester éthylique de tétraméthylrhodamine (TMRE

)REMARQUE : Dans ce protocole, le TMRE est utilisé en mode non extinction à une concentration finale de 20 nM. En général, il faut utiliser la concentration la plus faible possible de TMRE qui fournit encore une intensité de signal suffisante sur le microscope de son choix. En raison de l’évaporation inégale, le volume du milieu dans les différents puits peut différer dans les cultures primaires à long terme. Pour assurer une concentration constante de TMRE dans tous les puits, n’ajoutez pas de TMRE directement dans les puits. Au lieu de cela, remplacez le milieu dans chaque puits par la même quantité de milieu contenant de l’EMTr. Le protocole ci-dessous est conçu pour les neurones primaires dans des plaques à 24 puits contenant ~1 mL de milieu par puits.

1. En travaillant dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire, recueillir 500 μL de milieu de chaque puits dans un seul tube conique.
2. Par puits, ajouter 0,5 μL de stock TMRE de 20 μM dans le tube conique (par exemple, 12 μL pour 24 puits).
3. Aspirez soigneusement le fluide restant du premier puits et remplacez-le par 500 μL de fluide contenant de l’ERM. Continuez, puits par puits, avec les puits restants.
   REMARQUE : Veillez à ne pas laisser les cellules se dessécher et à ne pas déranger les cellules.
4. Remettez les cellules dans l’incubateur et attendez au moins 60 minutes pour l’équilibrage du colorant.
   REMARQUE : Le temps de chargement peut être prolongé à plusieurs heures sans effets indésirables.
5. Pour garantir une concentration et un équilibre constants des TMRE tout au long de l’expérience d’imagerie, assurez-vous d’inclure une concentration finale de 20 nM TMRE dans le tampon d’imagerie et toutes les solutions de stimulation.

2. Optimisation des paramètres du microscope confocal à balayage

REMARQUE : Cette étape vise à trouver le meilleur compromis entre la qualité d’image et la viabilité cellulaire lors de l’imagerie en direct. Cette section décrit l’optimisation des paramètres pour l’imagerie de la protéine fluorescente verte sensible à l’oxydation réductrice (roGFP). Si l’imagerie multiparamétrique est effectuée, une optimisation similaire, y compris la vérification d’une ligne de base stable sans signes de blanchiment ou de phototoxicité, doit être effectuée pour les indicateurs supplémentaires.

1. Démarrez le microscope confocal et chargez les paramètres standard pour l’imagerie GFP (excitation de 488 nm, émission de 505 à 550 nm).
2. Réglez le détecteur sur 12 bits ou 16 bits. note: Habituellement, 8 bits ne sont pas suffisants pour l’imagerie quantitative.
3. Activez le mode de balayage séquentiel et ajoutez une deuxième séquence/piste (excitation de 405 nm, émission de 505 à 550 nm).
4. Pour les deux canaux, sélectionnez une table de correspondance pseudo-couleur qui indique les pixels surexposés et sous-exposés (par exemple, GLOW OU).
5. Sélectionnez un objectif adapté à l’objet d’intérêt.
   REMARQUE : 10x-40x conviennent à l’analyse de cellules uniques, 63x-100x conviennent à l’analyse de mitochondries uniques.
6. Montez une lamelle avec des cellules dans la chambre d’imagerie, ajoutez 1 ml de tampon d’imagerie et placez la chambre sur le microscope.
7. Utilisez l’oculaire et la lumière transmise pour focaliser les cellules.
   REMARQUE : N’utilisez pas de lumière d’épifluorescence pour localiser et focaliser les cellules. Même à faible puissance, cela affectera négativement les cellules.
8. Enregistrez des images avec différents formats de pixels. Sur la base de ces images, sélectionnez le nombre de pixels le plus bas qui donne une résolution acceptable de la structure d’intérêt.
   REMARQUE : En règle générale, 512 x 512 pixels fonctionnent bien pour l’imagerie unicellulaire avec des objectifs 20x et 40x, et 1024 x 1024 ou 2048 x 2048 pixels fonctionnent généralement bien pour l’imagerie de mitochondrie unique avec un objectif 63x.
9. Enregistrez des images avec différentes tailles de sténopé. Sur la base de ces images, sélectionnez la plus grande taille de sténopé qui donne une résolution acceptable de la structure d’intérêt.
   REMARQUE : En règle générale, 3 à 7 unités aérées fonctionnent bien.
10. Enregistrez des images avec différentes intensités laser.
    1. Ajustez le gain et le seuil du détecteur en conséquence. Sur la base de ces images, sélectionnez l’intensité laser la plus basse qui donne une intensité de signal et un rapport signal/bruit de fond acceptables.
       1. Pour déterminer le rapport signal/arrière-plan, mesurez l’intensité du signal dans une région d’intérêt (ROI) qui contient des cellules ou des mitochondries (ROI1) et dans un ROI sans cellules ni mitochondries (ROI2). Ensuite, divisez l’intensité de ROI1 par l’intensité de ROI2.
          >REMARQUE : Visez un rapport signal/bruit de fond de >3 et des intensités de signal des ROI individuels de 200 à 1 000 pour une excitation de 405 nm avec une puissance laser de 1 à 3 % et des intensités de ROI individuelles de 300 à 1 500 pour une excitation de 488 nm avec une puissance laser de 1 %.
11. Enregistrez des images avec différentes vitesses de numérisation et nombre de moyennes d’images. Enregistrez 4 à 5 images pour chaque combinaison de paramètres. En fonction de ces séries d’images, sélectionnez la vitesse la plus élevée et les paramètres moyens les plus bas qui donnent un bruit d’image et une variabilité d’image à image acceptables.
    REMARQUE : Une vitesse de balayage de 600 Hz et 1 à 2 images pour le calcul de la moyenne fonctionnent bien dans la plupart des cas.
12. À l’aide d’une nouvelle lamelle, enregistrez une série de time-lapse avec les paramètres optimisés.
    REMARQUE : La durée et l’intervalle d’image de la série doivent ressembler à ceux des expériences prévues.
13. À la fin de la série time-lapse, ajoutez 1 mL de solution de diamide (DA) 2x dans la chambre d’enregistrement. Image pendant 2 min supplémentaires.
14. Aspirez le tampon d’imagerie à l’aide d’une pompe péristaltique ou d’une pipette manuelle. Ajouter 1 mL de solution de dithiothréitol (DTT). Image pendant 5 min supplémentaires.
15. Analysez l’expérience time-lapse.
    1. Vérifiez qu’aucun des deux canaux n’est sur- ou sous-exposé pendant le traitement DA et TNT avec les paramètres optimisés.
    2. Assurez-vous qu’aucun des deux canaux ne présente de blanchiment important pendant l’enregistrement en accéléré ; visez une perte d’intensité de <2 % entre la première et la dernière image.
    3. Vérifiez que le rapport 405:488 ne change pas considérablement pendant l’imagerie.
16. Répétez l’ensemble de la procédure de manière itérative, à l’aide de plusieurs lamelles, jusqu’à ce que des paramètres qui fournissent systématiquement des résultats acceptables aient été définis.

3. Évaluation de l’état redox basal

1. Démarrez le microscope et chargez les paramètres optimisés à partir de la section 2.
2. Réglez la moyenne du cadre sur 3-5.
3. Montez une lamelle avec des cellules dans la chambre d’imagerie, ajoutez 1 ml de tampon d’imagerie et placez la chambre sur le microscope.
4. Utilisez l’oculaire et la lumière transmise pour focaliser les cellules.
   REMARQUE : N’utilisez pas de lumière d’épifluorescence pour localiser et focaliser les cellules. Même à faible puissance, cela affectera négativement les cellules.
5. Passez en mode balayage et utilisez le canal 488 nm en mode en direct pour faire la mise au point et localiser les cellules pour l’imagerie.
6. Utilisez la fonction multipoint pour sélectionner 3 à 5 champs de vision sur la lamelle.
7. Enregistrez une image de référence.
8. Ajouter 1 mL de solution 2x DA dans la chambre.
9. Après 1, 2 et 3 min, utilisez la vue en direct pour confirmer/ajuster la mise au point, puis enregistrez une image.
   REMARQUE : Les cellules sont généralement complètement oxydées après 2 min.
10. Remplacez le tampon dans la chambre d’imagerie par 1 mL de solution DTT 1x.
11. Après 3 et 5 min, utilisez la vue en direct pour confirmer/ajuster la mise au point, puis enregistrez une image.
    REMARQUE : Les cellules sont généralement complètement réduites après 4 à 5 min.

4. Imagerie en direct des traitements aigus

REMARQUE : Le protocole ci-dessous décrit l’imagerie de la réponse redox mitochondriale au traitement NMDA. Il peut être nécessaire d’ajuster les intervalles d’images et la durée de l’expérience pour d’autres traitements.

1. Démarrez le microscope et chargez les paramètres optimisés de la section 3.
2. Réglez l’intervalle de temps sur 30 s et la durée sur 25 min.
3. Montez une lamelle avec des cellules dans la chambre d’imagerie, ajoutez 1 ml de tampon d’imagerie et placez la chambre sur le microscope.
   REMARQUE : Pour éviter la dérive thermique de la focale, laissez les cellules sur la platine du microscope pendant 10 à 15 minutes avant de commencer l’imagerie en accéléré.
4. Utilisez l’oculaire et la lumière transmise pour focaliser les cellules.
   REMARQUE : N’utilisez pas de lumière d’épifluorescence pour localiser et focaliser les cellules. Même à faible puissance, cela affectera négativement les cellules.
5. Passez en mode balayage et utilisez le canal 488 nm en mode en direct pour faire la mise au point et localiser les cellules pour l’imagerie.
6. Facultatif : Pour augmenter le nombre de cellules enregistrées par passage, utilisez la fonction multipoint pour imager 2 à 3 champs de vision par lamelle.
7. Démarrez l’acquisition en accéléré et enregistrez 5 images en tant qu’enregistrement de base de 2 minutes.
8. Ajoutez 500 μL de solution NMDA 3x dans la chambre (concentration finale 30 μM) et enregistrez 20 images supplémentaires en réponse NMDA de 10 minutes.
   REMARQUE : Les neurones sont très sensibles aux changements d’osmolarité. Par conséquent, assurez-vous de minimiser l’évaporation du tampon d’imagerie. Pour les traitements plus longs, la chambre d’imagerie doit être recouverte d’un couvercle.
9. Ajoutez 500 μL de solution 4x DA dans la chambre et enregistrez 6 images supplémentaires (étalonnage de 3 min maximum).
10. Aspirez le tampon de la chambre d’imagerie et remplacez-le par 1 mL de solution 1x DTT. Enregistrez 10 images supplémentaires (étalonnage minimum de 5 min).
11. Terminez l’enregistrement et sauvegardez la série d’images.

Matériaux